Quando il meno è più: come ottimizzare la microscopia a fluorescenza con Micro𝕊plit

I ricercatori di Human Technopole hanno sviluppato un nuovo metodo basato sul machine learning che trasforma immagini composte di microscopia a fluorescenza con segnali sovrapposti in immagini separate che rivelano singole strutture cellulari. La nuova metodologia è pubblicata su Nature Methods, con i modelli sperimentali e i dati di addestramento disponibili liberamente su GitHub.

Berlino, 1871. La polvere rosso-arancio si sciolse nell’acqua e un alone luminoso giallo-verde iniziò a brillare. Il chimico Adolf von Baeyer aveva appena creato la prima molecola fluorescente sintetica, più tardi chiamata fluoresceina.

A partire dalla scoperta rivoluzionaria di Baeyer, le molecole fluorescenti hanno trasformato il modo in cui gli scienziati osservano i sistemi biologici al microscopio. Marcando strutture cellulari a scelta, i ricercatori possono ora tracciare la localizzazione delle proteine, monitorare l’espressione genica, osservare l’organizzazione intracellulare, individuare interazioni tra cellule, svolgere imaging di cellule vive, e molto altro.

La sfida si fa più grande quando i ricercatori vogliono visualizzare diverse strutture cellulari in una volta sola. La microscopia a fluorescenza multispettrale si basa sulla combinazione di fluorofori i cui spettri di eccitazione ed emissione possono essere chiaramente separati. Quando questi spettri si sovrappongono, i segnali potrebbero fuoriuscire nel canale sbagliato, producendo effetti indesiderati come crosstalk, bleedthrough, e immagini potenzialmente fuorvianti. La selezione del corretto insieme di fluorofori è un’arte a sé: bisogna conoscere le proprietà di ogni colore per ottenere il miglior effetto visivo, proprio come fanno gli artisti.

Anche quando viene selezionata una palette di fluorofori appropriata, i campioni non possono essere sottoposti a imaging per un tempo indefinito. Un’esposizione ripetuta o prolungata può causare fotobleaching, un fenomeno in cui i fluorofori perdono la loro capacità di emettere luce. Perciò, scegliere tempi di esposizione più corti o meno frequenti è fondamentale per evitare di esaurire la fonte di fluorescenza.

Trovare un equilibrio tra intensità del segnale, specificità e conservazione dei campioni è una sfida costante per i microscopisti. Anche il premio Nobel Eric Betzig lo ha sottolineato nel suo discorso in occasione della cerimonia di conferimento del premio Nobel per la Chimica 2014, evidenziando la rilevanza e la diffusione di questo problema.

Recentemente, il gruppo di ricerca di Florian Jug a Human Technopole ha sviluppato un modo per facilitare la ricerca di questo equilibro. Il loro nuovo metodo, chiamato Micro𝕊plit, permette di sovrapporre molteplici strutture cellulari marcate fluorescentemente in un singolo canale che corrisponde a un solo colore collettivo. L’immagine ottenuta con le strutture sovrapposte viene poi decomposta computazionalmente mediante separazione spettrale in diversi canali, ciascuno dei quali mostra una delle strutture marcate.

Florian Jug, Group Leader nel Centro di Biologia Computazionale e autore senior di questo studio, spiega: “È un po’ come fotografare un gruppo di persone in uno scatto invece che fare foto individuali, e poi utilizzare un software che ti restituisce i ritratti singoli in modo affidabile.”

Micro𝕊plit può essere addestrato usando diversi tipi di dati microscopici, adattandosi così al materiale biologico a disposizione. Può imparare da immagini precedentemente acquisite di strutture individuali o multispettrali, o da nuovi dataset di addestramento in cui vengono acquisite immagini sia separate sia miste. Una volta addestrato, può trasformare un’immagine di input mista in immagini delle strutture individuali senza rumore di fondo, anche quando gli stessi dati di addestramento sono rumorosi.

Le immagini generate da Micro𝕊plit mediante separazione spettrale e riduzione del rumore si basano sulle predizioni di una rete neurale artificiale. A partire dal materiale di addestramento messo a diposizione, il metodo supportato dal machine learning predice come le strutture sovrapposte siano distribuite nello spazio e le divide in immagini separate, ciascuna delle quali mette in evidenza un tipo di struttura biologica. Nei casi in cui le immagini di input siano ambigue, possono essere generate molteplici soluzioni. Guardando la loro variabilità è possibile determinare il tasso di certezza e di errore delle predizioni. Bassa diversità è un segno di elevata accuratezza, mentre alta variabilità indica soluzioni ambigue e un tasso di errore potenzialmente elevato. Questa proprietà intrinseca di Micro𝕊plit permette agli utenti di identificare e scartare immagini intere o parziali con previsioni inaffidabili, e allo stesso tempo garantisce che le immagini separate spettralmente predette con consistenza siano di alta qualità. Questa caratteristica consente agli utenti di verificare le previsioni generate dall’intelligenza artificiale e scegliere di fidarsi del sistema basandosi su evidenze e non alla cieca. “Un metodo di intelligenza artificiale il cui solo prodotto è una bella immagine è inutile per uno scienziato”, enfatizza Florian Jug. “Anche il risultato di Micro𝕊plit è un’immagine, ma completata da una mappa che indica dove l’immagine potrebbe essere sbagliata.”

Oltre a separare diverse strutture cellulari, Micro𝕊plit può anche individuare artefatti di imaging. In casi di rumore strutturato nell’immagine di input, Micro𝕊plit può aiutare a rimuoverlo, a patto che non sia sempre sovrapposto alle strutture di interesse. Questa applicazione è estremamente utile e differenzia Micro𝕊plit da altri metodi di riduzione del rumore nelle immagini basati sul contenuto.

In aggiunta all’identificazione e separazione spettrale delle strutture cellulari e alla rimozione degli artefatti, Micro𝕊plit può rendere possibile un’ampia gamma di analisi successive. Per esempio, questo metodo potrebbe essere usato per tracciare la presenza, l’assenza, o l’esatto numero di determinate strutture cellulari, per calcolare le loro proprietà dimensionali, o per studiare le interazioni tra diverse componenti della cellula in varie condizioni sperimentali. Essendo soltanto da poco a disposizione della comunità scientifica, il suo potenziale non è ad oggi pienamente esplorato e nuove entusiasmanti applicazioni possono ancora essere scoperte.

Per facilitare l’ulteriore implementazione e riutilizzo di questo metodo da parte di altri ricercatori, il pacchetto completo di Micro𝕊plit, inclusi i dati di addestramento e valutazione, come anche i notebook di esempio di tutti gli esperimenti svolti, è accessibile pubblicamente. Chiunque abbia a disposizione un qualsiasi microscopio a fluorescenza può beneficiarne immediatamente, poiché Micro𝕊plit è compatibile con qualunque strumento di imaging. Inoltre, il gruppo di ricerca di Florian Jug sta ora lavorando allo sviluppo di strumenti grafici facili da usare per offrire agli utenti un supporto continuo dall’acquisizione delle immagini alla visualizzazione dei dati, ampliando ulteriormente l’accessibilità a Micro𝕊plit da parte della comunità scientifica.

Dalla prima molecola fluorescente sintetica alla separazione spettrale delle immagini basata sul machine learning, il progresso scientifico ha continuamente espanso l’orizzonte visibile ai ricercatori. Micro𝕊plit può contribuire a spostare i limiti ancora più avanti ottimizzando la microscopia a fluorescenza in modo da permettere l’estrazione di più informazioni da meno dati.