Piattaforma Nazionale di Biologia Strutturale

Per garantire la massima produttività e qualità della ricerca, la Piattaforma si avvale di attrezzature all’avanguardia. L’elenco delle tecnologie disponibili per l’accesso dell’utente esterno all’unità di microscopia crioelettronica (IU1) comprende:

• Thermo Scientific Titan Krios G4i 300kV TEM dotato di rivelatore di elettroni diretti Thermo Scientific Falcon 4i, filtro energetico Thermo Scientific Selectris X, Thermo Scientific CETA 16M e piastra di fase Volta;
• Thermo Scientific Spectra 300kV STEM dotato di Thermo Scientific CETA 16M con potenziamento della velocità, completamente dedicato ai flussi di lavoro di tomografia elettronica;
• Thermo Scientific Glacios 200kV TEM equipaggiato con Thermo Scientific Falcon 4i, filtro energetico Thermo Scientific Selectris X e piastra di fase CETA-D e Volta;
• Thermo Scientific Talos L120C 120kV TEM equipaggiato con Thermo Scientific CETA 16M per consentire l’imaging sia a temperatura ambiente che criogenico con il cryo-holder Gatan ELSA;
• Microscopio confocale Leica Stellaris 5 equipaggiato con laser a luce bianca e crio-stadio per eseguire esperimenti di crio-CLEM. Microscopio a campo largo Leica Thunder dotato di crio-stadio per eseguire esperimenti di crio-CLEM;
• Apparecchiature ausiliarie per la preparazione dei campioni, tra cui: dispositivi di congelamento a immersione (Thermo Scientific Vitrobot Mark IV), unità di scarico del bagliore (Pealco EasyGlow e Quorum GloQube), pulitore al plasma (Gatan Solarus II), sistema di rivestimento al carbonio (Leica ACE600) e altri strumenti di preparazione dei campioni per il congelamento ad alta pressione (Leica EM ICE) e la sostituzione del congelamento (Leica AFS2).

L’unità di produzione di biomassa fornisce un’ampia gamma di attrezzature per la coltivazione di cellule, che facilitano l’espressione di proteine su varie scale e garantiscono la scalabilità dei bioprocessi, comprese le produzioni su larga scala.

Attrezzature per la coltivazione cellulare:

• Agitatori: nove agitatori dedicati specifici per la coltivazione di cellule di lievito, batteri, mammiferi e insetti.
• Fermentatore da 15L: fermentatore compatto adatto per lieviti e batteri, con un volume massimo di lavoro di 10L. Ideale per la produzione su piccola scala e per i test e lo scale-up dei bioprocessi, supporta processi batch e fed-batch. Dotato di controlli per pH, pO2, temperatura e torbidità.
• Fermentatore da 150L: unità di fermentazione più grande per lieviti e batteri, con un volume massimo di lavoro di 100L. Progettato per produzioni su larga scala, offre processi batch e fed-batch e dispone di controlli per pH, pO2, temperatura, torbidità e pressione.
• Bioreattore da 0,5L: piccolo bioreattore progettato per le cellule di mammifero, utile per testare le cellule nel bioreattore e impostare le condizioni di coltivazione, con un volume di lavoro massimo di 400mL. Dotato di controlli per pH, pO2 e temperatura e di un modulo di perfusione – BioSep.
• Bioreattore da 10L: bioreattore dedicato alla produzione di cellule di mammifero, che supporta fino a 10L di volume massimo di lavoro. Dispone di controlli per pH, pO2 e temperatura e di un modulo di perfusione – BioSep.

Apparecchiature per la raccolta delle cellule:

• Centrifuga ad alta velocità: centrifuga ad alta velocità in grado di trattare campioni con una capacità fino a 6 litri.
• Centrifuga tubolare ad alta velocità: una centrifuga semi-continua su larga scala che offre flussi che vanno da 25 a 330 L/h. Consente la separazione centrifuga in un intervallo compreso tra 2’800 g e 15’500 g.

Apparecchiature per la lisi cellulare:

• Disgregatore cellulare ad alta pressione: utilizza l’alta pressione per disgregare la membrana plasmatica delle cellule, con una capacità di trattamento a flusso continuo fino a 6 litri all’ora. La pressione massima di processo raggiunge i 40kpsi (2700 bar).

Freezer Mill: disgrega le cellule raffreddandole a temperature criogeniche, seguite da una disgregazione meccanica mediante un impattatore magnetico in acciaio. Le temperature criogeniche vengono mantenute per tutta la durata del processo, impedendo qualsiasi degradazione termica. È in grado di macinare campioni da 0,1 a 100 grammi.

L’Unità di Analisi Biofisica gestisce la strumentazione che consente la caratterizzazione biofisica di campioni macromolecolari e la determinazione delle loro affinità di interazione. La strumentazione disponibile presso l’Unità comprende:

• Refeyn OneMP (fotometria di massa), che permette di determinare la massa delle macromolecole in soluzione e l’omogeneità del campione;
• Sartorius Octet R8 (bio-layer interferometry – BLI), che consente di monitorare il legame tra macromolecole, la loro specificità, le cinetiche di associazione e dissociazione e permette di quantificare ligandi noti in miscele complesse;
• Nanotemper Monolith (termoforesi su microscala), dotato di rivelatori pico RED e labelfree, che consente di determinare la costante di affinità utilizzando quantità estremamente ridotte di campioni;
• MicroCal PEAQ-ITC (calorimetria a titolazione isotermica), che, misurando le variazioni di calore che si verificano al momento dell’interazione tra macromolecole, consente di determinare l’affinità, la stechiometria e l’entalpia dell’interazione;
• Wyatt OptiLab e DAWN, accoppiati al sistema Cytiva Äkta Micro, (SEC-MALS) consentono di determinare la massa molare delle macromolecole separate in cromatografia di esclusione dimensionale, fornendo informazioni sulla massa e sull’omogeneità dei campioni macromolecolari;
• Xtal Concepts Spectrolight 610 (diffusione dinamica della luce) consente di misurare le dimensioni e la distribuzione dimensionale delle macromolecole in volumi di nanolitri;
• Nanotemper Prometheus (nano fluorimetria a scansione differenziale) che consente di misurare il profilo di denaturazione di una proteina monitorandone fluorescenza intrinseca e rilevandone l’aggregazione durante il processo.

L’unità di proteomica strutturale si occupa di tutto, dall’estrazione delle proteine alla digestione, al frazionamento dei peptidi, all’acquisizione della spettroscopia di massa e all’analisi dei dati, con particolare attenzione alla SM crosslinking. Gli strumenti comprendono:

Spettrometro di massa:

• Spettrometro di massa Thermo Scientific Orbitrap Eclipse Tribrid, dotato di ETD. Dotato anche di attacco per la mobilità ionica asimmetrica ad alto campo (FAIMS).
• HPLC Thermo Vanquish Neo in linea con lo spettrometro di massa, dotato di forno per colonne;

Preparazione dei campioni:

• Akta Micro FPLC equipaggiato per cromatografia ad esclusione dimensionale, scambio cationico forte, cromatografia a scambio anionico idrofilo;
• Bagno sonicatore Bandelin RK-100;
• Concentratore Eppendorf Speed-vac;
• Accesso a Thermo Vanquish Duo HPLC offline per cromatografia peptidica aggiuntiva;
• Apparecchiature per la digestione in gel o in soluzione con StageTip, Sep-Pak, SP3, pulizia iST o arricchimento di fosfati.

Dynamic Single Molecule (DSM) fornisce strumenti per visualizzare i processi biologici in tempo reale con la sensibilità di una singola molecola. La piattaforma si basa su due strumenti all’avanguardia, che combinano le pinzette ottiche con vari moduli di rilevamento a fluorescenza e senza etichetta:

• Dymo700: fino a quattro trappole ottiche (Q-trap), imaging confocale con 3 canali di rilevamento, modulo STED aggiuntivo per chimografie a super risoluzione 1D. Il Dymo è utilizzato prevalentemente per l’imaging “in soluzione”.
• Edge350: due trappole ottiche standard, rilevamento della fluorescenza a 3 colori (sensibilità alle singole molecole) basato su illuminazione a campo largo o TIRF, imaging aggiuntivo senza etichetta basato su IRM, che rende questo strumento ideale per i saggi basati sulla superficie.

Mentre il rilevamento di singole molecole consente l’osservazione diretta con un’elevata risoluzione spaziale e temporale, le pinzette ottiche hanno la capacità unica di manipolare/perturbare i sistemi biologici applicando forze pN in modo altamente controllato. Questo approccio integrato fornisce informazioni complementari alle strutture ad alta risoluzione, svelando le dinamiche alla base dei processi molecolari.

Ulteriori informazioni sono disponibili su: https://lumicks.com/dsm-overview/