Knock-in di geni di Chlamydomonas reinhardtii con CRISPR/Cas

Il Pigino Group presenta un protocollo basato su CRISPR/Cas per l’inserimento mirato di geni esogeni nel genoma dell’alga verde unicellulare Chlamydomonas, che consente un rapido screening high-throughput delle cellule mutanti.

Chlamydomonas reinhardtii è un organismo modello semplice e ampiamente utilizzato: allo stato vegetativo, l’alga è aploide (ovvero contiene un unico set di cromosomi) e rappresenta quindi un modello prezioso per gli studi genetici funzionali.

Il sistema CRISPR/Cas è uno strumento per modificare il genoma degli organismi viventi che è stato utilizzato con successo per inattivare funzionalmente i geni in molte specie, tra cui Chlamydomonas. La perdita di funzione di un determinato gene in Chlamydomonas può essere recuperata introducendo una copia funzionale esogena di tale gene, che può essere fusa con un tag per ulteriori studi biochimici e/o di microscopia. Chlamydomonas però può solo incorporare casualmente DNA esogeno nel suo genoma attraverso la giunzione delle estremità non omologhe (NHEJ). Tuttavia, l’inserimento di lunghi tratti di DNA esogeno è un evento raro e può interrompere la sequenza del genoma di Chlamydomonas in siti sconosciuti. Inoltre, la ricombinazione NHEJ non garantisce il corretto orientamento dell’inserto.

Adrian Nievergelt e Gaia Pigino del Centro di Ricerca in Biologia Strutturale di Human Technopole hanno ideato un metodo per la mutagenesi knock-in dei geni in Chlamydomonas. Il protocollo si basa su un meccanismo di riparazione della doppia elica del DNA chiamato riparazione diretta dall’omologia (HDR) e sul sistema CRISPR/Cas, che facilita il corretto orientamento e l’inserimento preciso del frammento di DNA esogeno nel genoma di Chlamydomonas. I ricercatori hanno costruito una serie di vettori per purificare cassette di DNA esogeno affiancate da sequenze omologhe che, una volta inserite nelle cellule insieme alle ribonucleoproteine Cas, consentono la ricombinazione con il genoma dell’alga. Inoltre, grazie a questo sistema, le cellule knock-in possono essere facilmente selezionate con l’uso di antibiotici, seguiti da citofluorimetria (o FACS dall’inglese Fluorescence Activated Cell Sorting) delle cellule mutanti e da un successivo high-throughput screening mediante PCR quantitativa. I risultati della ricerca sono ora pubblicati su Cell Reports Methods.

In sintesi, Nievergelt e Pigino dimostrano che il loro metodo può essere utilizzato con successo per produrre linee cellulari knock-in, ossia con diretto e puntiforme inserimento di geni nella sequenza dell’alga, in poche settimane. Un  approccio che troverà largo impiego in vari laboratori che utilizzano Chlamydomonas come organismo per studiare vari aspetti della biologia dalle ciglia e li cigliopatie alla fotosintesi o la divisione cellulare.