Nuovi strumenti per l’analisi degli screening CRISPR-Cas9

Diversi metodi di classificazione supervisionata possono essere utilizzati per l’analisi degli screening genetici ottenuti con la tecnologia di editing genomico CRISPR-Cas9. Tuttavia, questi metodi richiedono grandi insiemi di geni noti di riferimento da includere tra quelli da esaminare. Alessandro Vinceti dello Iorio Group, presenta un nuovo metodo computazionale per identificare un gruppo ristretto di geni di riferimento che consente analisi supervisionate di screening CRISPR-Cas9 su scala limitata e che ha un impatto minimo sulle dimensioni dello screening.

Gli screening CRISPR-Cas9 sono strumenti preziosi per identificare geni coinvolti in diversi processi biologici in vari modelli sperimentali di cancro e altre patologie. Condotti a livello di intero genoma e su larga scala (in inglese, screening genome-wide), questi screening sono stati utilizzati con successo per cercare geni coinvolti nella resistenza e nella sensibilità ai farmaci, nonché quelli essenziali per la sopravvivenza delle cellule tumorali. In un tipico screening CRISPR-Cas9 genome-wide, il modello sperimentale di interesse viene ingegnerizzato per esprimere l’endonucleasi Cas9 e successivamente trattato con una libreria CRISPR di RNA a singola guida (sgRNA) per indirizzare specificamente la nucleasi Cas9 verso ciascun gene in singole cellule, ed abolirne cosí l’espressione. Gli screening CRISPR-Cas9 focalizzati, o a scala limitata, mirano invece a gruppi più ristretti di geni, richiedono un numero inferiore di sgRNA rispetto agli screening genome-wide e possono essere eseguiti molto più facilmente su sistemi complessi, come gli organoidi e i modelli in vivo.

Diversi metodi analitici supervisionati sono stati proposti per analizzare i risultati degli screening CRISPR-Cas9, con diversi obiettivi che vanno dal controllo della qualità dei dati al loro ridimensionamento per la comparazione di diversi screening e l’identificazione dei geni essenziali per la sopravvivenza della cellula (in inglese, “fitness genes”). I metodi di classificazione supervisionata sono strumenti informatici che necessitano di esempi di oggetti già classificati da cui imparare a classificarne di nuovi. Quando vengono applicati agli screening CRISPR-Cas9, questi metodi si basano sull’esistenza di geni di riferimento che sono noti per essere sempre essenziali oppure mai necessari per la sopravvivenza delle cellule. Questi geni devono essere inclusi tra quelli specificamente inattivati dalla libreria CRISPR e vengono utilizzati come “esempi” per prevedere la funzione di tutti gli altri geni (e quindi classificarli in essenziali o non essenziali alla sopravvivenza cellulare).

Il più piccolo dataset di geni di riferimento attualmente disponibile è costituito da circa 1.600 geni. Ciò rende difficile l’uso di metodi supervisionati per l’analisi di dati derivanti da CRISPR-Cas9 screening a scala limitata, in cui il numero di geni di riferimento sarebbe paragonabile o addirittura superiore a quello dei geni in esame.

Per superare questa limitazione, Alessandro Vinceti – dottorando SEMM del gruppo di ricerca guidato da Francesco Iorio presso il Centro di Biologia Computazionale HT – ha sviluppato Minimal Template Estimator (MinTEs), un metodo computazionale per la generazione di dataset di geni di riferimento di piccole dimensioni per l’analisi supervisionata di screening CRISPR-Cas9 a scala limitata. Questo lavoro è stato pubblicato su Cell Reports.

MinTEs è “addestrato” utilizzando set di dati proventi da screening CRISPR-Cas9 su larga scala che sono disponibili pubblicamente e che sono stati effettuati su centinaia di linee cellulari tumorali immortalizzate all’interno dell’archivio Cancer Dependency Map (DepMap), utilizzando librerie di sgRNA precedentemente disegnate per screening genome-wide. Ciò ha permesso di ridurre il numero dei geni di riferimento da migliaia a centinaia o adirittura a poche decine (chiamati “reduced templates” o RT), che possono essere quindi utilizzati agevolmente per l’analisi di screening CRISPR-Cas9 a scala limitata.

“La nostra metodologia ha il potenziale per ridurre i costi, far risparmiare tempo per gli screening a scala limitata e semplificare esperimenti su organoidi e altri sistemi complessi, offrendo maggiori opportunità di studiare l’essenzialità genica in una varietà di contesti patologicamente rilevanti“, afferma Alessandro Vinceti, primo autore dello studio.

In sintesi, Vinceti, Iorio e colleghi presentano un nuovo metodo computazionale per disegnare insiemi di RT dipendenti e indipendenti dalla libreria di partenza per l’analisi supervisionata di screening CRISPR-Cas9 a scala ridotta. Sebbene gli RT generati da MinTEs non siano ancora stati testati su set di dati più complessi, come quelli provenienti da xenotrapianti derivati da pazienti o da screening in vivo, questi risultati dimostrano che è possibile ridurre le dimensioni dei set di geni di riferimento mantenendo alte le loro prestazioni analitiche e rendendone l’utilizzo possibile in analisi di screening a scala limitata, che possono essere eseguiti facilmente in modelli sperimentali sia semplici che complessi.