Misurazione della compattazione della cromatina con FRET-FISH

I coloranti intercalanti del DNA e le tecniche di sequenziamento massivo sono tradizionalmente utilizzati per studiare la compattazione della cromatina nucleare. Questi strumenti, tuttavia, non consentono di misurare direttamente la compattazione della cromatina di singoli loci. Nicola Crosetto e Magda Bienko combinano due tecniche di microscopia – il trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza (FRET) e l’ibridazione in situ a fluorescenza (FISH) del DNA – per valutare il livello di compattazione della cromatina in loci selezionati in singole cellule.

La compattazione della cromatina – definita come massa di cromatina per unità di volume – è un indicatore dell’attività della cromatina. La cromatina altamente condensata è spesso povera di geni e trascrizionalmente silenziata (eterocromatina), mentre quella compatta è tipicamente ricca di geni e trascrizionalmente attiva (eucromatina). Pertanto, la mappatura delle regioni di cromatina condensata e libera all’interno del nucleo può aiutare a comprendere l’attività di una cellula. Diverse tecniche di colorazione e coloranti fluorescenti intercalanti del DNA hanno permesso di identificare le regioni arricchite di eucromatina ed eterocromatina. Tuttavia, questi coloranti si legano preferenzialmente a determinate sequenze genomiche e ciò preclude la misurazione diretta della compattazione cromatinica di geni e marcatori genetici. Allo stesso modo, gli strumenti di sequenziamento massivamente paralleli che si basano sull’accessibilità degli enzimi di taglio del DNA al DNA stesso nel nucleo non possono valutare fedelmente la condensazione della cromatina. Infatti, il DNA densamente rivestito di proteine rimarrebbe inaccessibile a questi enzimi, anche quando è poco impacchettato e occupa un grande volume nel nucleo. L’ibridazione in situ a fluorescenza (FISH) utilizza sonde di DNA marcate con nucleotidi fluorescenti per individuare specifiche posizioni cromosomiche in cellule fissate, ottenendo segnali colorati che possono essere rilevati con un microscopio a fluorescenza. Sebbene questa tecnica sia ampiamente utilizzata nella diagnostica e nella ricerca di base per visualizzare loci di DNA definiti in singole cellule, essa non è mai stata adottata per l’analisi sistematica della compattazione della cromatina.

Nicola Crosetto e Magda Bienko – rispettivamente Senior Manager e Group Leader del Genomics Centre di Human Technopole – hanno integrato la metodica FISH con il trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza (FRET) per sviluppare una nuova tecnica basata sulla microscopia – FRET-FISH – in grado di misurare la compattazione della cromatina in corrispondenza di loci genici discreti in singole cellule. Questo lavoro è stato pubblicato su Nature Communications. La FRET è una tecnica che si basa sul trasferimento di energia tra un donatore e un accettore eccitati dalla luce ed è stata ampiamente utilizzata per studiare le interazioni proteina-proteina e proteina-DNA, nonché i cambiamenti conformazionali di proteine e acidi nucleici. Poiché il trasferimento di energia è inversamente proporzionale alla distanza tra donatore e accettore, una bassa efficienza FRET è indicativa di una coppia donatore-accettore fisicamente distante.

Crosetto e Bienko hanno progettato sonde FISH a DNA contenenti coloranti FRET donatori e accettori, che mirano a sequenze di DNA prossimali. Le hanno testate in cellule leucemiche umane fissate e hanno utilizzato i segnali (visibili come punti luminosi al microscopio a fluorescenza) FRET-FISH per valutare la compattazione della cromatina, con punteggi FRET-FISH alti e bassi che indicano rispettivamente compattazione e rilassamento della cromatina.

“Le misurazioni FRET sono notoriamente impegnative in cellule fissate e la combinazione di FRET e DNA FISH non è mai stata descritta prima“, afferma Nicola Crosetto.

I ricercatori hanno ottimizzato il design delle sonde FRET-FISH per il gene Ogt, situato sul cromosoma X, nei fibroblasti embrionali di topo. Per valutare la riproducibilità della FRET-FISH e convalidare la tecnica, i ricercatori hanno progettato sonde contro sei geni del cromosoma X del topo: tre geni inattivati costitutivamente e tre che sfuggono frequentemente all’inattivazione del cromosoma X. Le analisi FRET-FISH hanno rivelato che questi sei loci si trovavano effettivamente in due stati di compattazione distinti, correlati al loro stato di attivazione. Infine, hanno dimostrato che la FRET-FISH è in grado di rilevare i cambiamenti globali indotti da farmaci che modificano lo stato di condensazione della cromatina nucleare ovvero cambiamenti dello stato di condensazione della cromatina durante le fasi del ciclo cellulare o l’invecchiamento cellulare.

In sintesi, Crosetto e Bienko presentano un saggio versatile per sondare la compattazione della cromatina in loci discreti in singole cellule. Questa tecnica apre la strada a un’esplorazione più dettagliata di diversi aspetti strutturali dell’organizzazione del genoma:

“Oltre a studiare la compattazione locale della cromatina, pensiamo che la FRET-FISH possa essere applicata anche per studiare i contatti tra sequenze regolatrici del genoma, come i promotori e gli enhancer, ma anche l’organizzazione dei loop cromatinici in singole cellule, senza dover ricorrere a tecniche di microscopia più sofisticate. Inoltre, il design delle sonde FRET-FISH può essere adattato per rilevare le interazioni tra DNA e RNA e RNA con RNA in singole cellule“, afferma Magda Bienko, suggerendo così che la FRET-FISH potrebbe presto diventare uno strumento chiave per gli scienziati che studiano l’organizzazione del genoma.